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一步法RT-qPCR實驗優(yōu)化小技巧

 更新時間:2024-05-16 點擊量:466

常見的RT-qPCR流程一般分為RNA提取,逆轉(zhuǎn)錄、熒光定量PCR三個步驟,當(dāng)有的課題需要對某物種進行多種處理后,檢測某個基因的表達水平,以驗證該基因應(yīng)對不同脅迫壓力的耐受力;或者經(jīng)某種病原菌侵染后,檢測寄主不同基因的表達水平,以探究可能涉及的通路及互作機理等……對于這幾類樣本數(shù)量較大,但樣本只需要檢測一次的實驗方案,我們常常推薦一步法RT-qPCR,即逆轉(zhuǎn)錄與熒光定量PCR配制一管體系,只需一次上機即可完成表達量的檢測。

由于將RNA逆轉(zhuǎn)錄與熒光定量PCR的體系配制合為一步,那么對于實驗操作的精準度及污染控制就極為重要,針對一步法RT-qPCR的特殊性,以下總結(jié)了一步法RT-qPCR實驗優(yōu)化技巧可有效提高實驗結(jié)果的穩(wěn)定性及準確性。

1. 目的片段選擇

① 選擇80-200 bp擴增子可保證PCR擴增效率zui大化

② 片段GC含量建議控制在40% ~ 60%

③ 避免擴增子與模板其他位置出現(xiàn)長片段的重復(fù)序列

④ 避免擴增子出現(xiàn)二級結(jié)構(gòu)

2. RNA模板制備

① 盡量選擇高產(chǎn)量、高純度的RNA提取試劑

② RNA可以保存在含有EDTA溶液 (1 × TE) 中,EDTA可螯合金屬離子來消除對RNase的催化作用,以此保證RNA的完整性

③ RNA提取后可以使用DNase I (ATG #E103) 消化基因組DNA殘留

3. 引物設(shè)計

① 常規(guī)引物長度15-30 nt,理想的引物GC含量40-60%,Tm值盡量接近60℃,且上下游引物Tm值相差盡量3℃以內(nèi),避免4個重復(fù)性的堿基序列,尤其是4G堿基

② 引物濃度按說明書推薦值添加,引物投入量過多,可能產(chǎn)生引物二聚體或非特異擴增,熔解曲線會出現(xiàn)雜峰

③ cDNA為模板時,建議引物區(qū)域跨越內(nèi)含子,這樣減少以基因組DNA模板進行擴增的假陽性

4. 探針設(shè)計

① 常規(guī)探針長度15-30 nt,以保證熒光基團能夠有效猝滅,GC含量保持40-60%

② 一般情況下,非熒光猝滅基團比熒光猝滅基團更有信噪比

③ 避免5’端為G堿基,否則會猝滅熒光基團

④ 設(shè)計的探針應(yīng)該結(jié)合到正義鏈或反義鏈上

⑤ 一般探針Tm值要比引物Tm值高5-10℃,保證引物結(jié)合前探針的全部序列與模板充分結(jié)合

5. 多重擴增

① 避免探針、引物之間及目的序列之間沒有重疊序列

② 設(shè)計探針時,保證每個目的序列有唯yi的用于檢測的熒光基團

③ 根據(jù)實時定量PCR儀檢測范圍來選擇熒光基團,熒光報告基團的發(fā)射光譜不能有重疊

④ 在單重反應(yīng)中檢測每一組引物/探針組合,以設(shè)置一個基線標(biāo)準,確保在多重PCRCt值接近

⑤ 高豐度目的序列可搭配低強度熒光染料,低豐度目的序列則搭配高強度熒光染料

6. 逆轉(zhuǎn)錄

 

① 一般建議逆轉(zhuǎn)錄這一步的反應(yīng)溫度按照試劑說明書設(shè)置,對于具有復(fù)雜二級結(jié)構(gòu)或高GC區(qū)域的模板,建議提高反應(yīng)溫度,有助于提升擴增效率和靈敏度。

7. 循環(huán)條件

① 一般情況下,按照說明書中的循環(huán)條件即可達到最佳效果

② 可以進行較長片段擴增 (>400 bp),但可能需要優(yōu)化延伸時間

③ 對于大多數(shù)情況,40個循環(huán)是足夠的,極低起始量的可以進行45個循環(huán)

8. 建立反應(yīng)

① 為了達到最佳結(jié)果,在熱循環(huán)之前請將反應(yīng)體系放在冰上

② 對于96孔板,推薦使用20 μl反應(yīng)體系。使用384孔板,推薦10 μl反應(yīng)體系

③ 每一個樣本應(yīng)設(shè)置三個重復(fù),保證每一個擴增子包含陰性對照 (NTC)

④ 為了避免交叉污染,熱循環(huán)前加入熱敏UDG37℃處理10 min

9. 檢測評估

① 確保至少三個10倍梯度稀釋模板的擴增效率達到90-110%,相關(guān)系數(shù)(R2) 應(yīng)>0.99

② 通過產(chǎn)物的長度、測序或熔解曲線分析確認其特異性

以上就是有關(guān)于一步法RT-qPCR實驗優(yōu)化技巧的全部內(nèi)容,如果你想了解更多請咨詢百奧創(chuàng)新客服!


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